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       2024年7月4日（周四），中國老年保健協(xié)會、一味書院主辦的【檢驗(yàn)月月壇】系列會議第13期“多方法學(xué)助力自身抗體實(shí)驗(yàn)室檢測”全國直播會在線上如期召開。大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院李士軍教授擔(dān)任大會主席并致辭，遼寧省中醫(yī)院張程教授，以及青島市婦女兒童醫(yī)院宋金蓮教授擔(dān)任本次會議的講者嘉賓。同時(shí)大會還邀請了中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院安成教授、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院周海舟教授作為本次會議的討論嘉賓。幾位專家主要圍繞“多方法學(xué)助力自身抗體實(shí)驗(yàn)室檢測”進(jìn)行了深入的交流和討論。

大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院  李士軍教授

       開幕致辭環(huán)節(jié)，李士軍教授對線上各位觀眾的參與表示歡迎，對本次會議的各位講者和主持人表示感謝。李士軍教授指出自身抗體檢測對于自身免疫性疾病的診斷、鑒別診斷、病情評估、治療監(jiān)測、預(yù)后判斷有著非常重要的作用，我國在自身免疫性疾病領(lǐng)域的深耕精作已經(jīng)取得了矚目的成績，檢驗(yàn)科已經(jīng)有能力為自身免疫性疾病的臨床實(shí)驗(yàn)室診斷提供更加全面、完善的檢測方法學(xué)和檢測項(xiàng)目，目前自身抗體檢測有多種方法學(xué)，每種方法學(xué)都有其獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值和局限性，今天的主題是多方法學(xué)聯(lián)合助力自身抗體實(shí)驗(yàn)室檢測，探討不同類型的自身抗體檢測也有不同的檢測策略。而每種方法學(xué)都有其獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值和局限性，今天的主題是多方法學(xué)聯(lián)合助力自身抗體實(shí)驗(yàn)室檢測，探討不同類型的自身抗體檢測也有不同的檢測策略。

       學(xué)術(shù)分享環(huán)節(jié)，張程教授為大家介紹了常見的自身免疫性疾病以及自身抗體對該疾病診療價(jià)值。自身免疫性疾病發(fā)病隱匿，表現(xiàn)復(fù)雜多樣，這給疾病診斷帶來了極大的困難。而自身抗體的檢測能用于輔助疾病的診斷、鑒別診斷，病情評估，判斷預(yù)后等重要作用，在自身免疫性疾病的診療過程起著重要作用。不僅如此，自身抗體檢測還對疾病有著預(yù)警作用。如定期檢測CCP，可以有助于提早發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。接下來張程教授介紹了臨床中較為常見的自身免疫疾病，如：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗磷脂綜合征、ANCA相關(guān)血管炎、自身免疫性肝病、干燥綜合征。張程教授結(jié)合指南深入淺出的介紹了這幾個(gè)疾病的臨床癥狀以及相關(guān)抗體的臨床應(yīng)用，令我們受益匪淺。

       緊接著宋金蓮教授進(jìn)行了題為“多方法學(xué)助力自身抗體檢測”的學(xué)術(shù)報(bào)告。宋教授主要從三個(gè)方面展開講解，分別是自身抗體的臨床應(yīng)用和檢測策略、自身抗體檢測的方法學(xué)概述和檢測策略推薦。宋教授利用5個(gè)臨床病例生動的闡述了自身抗體檢測對疾病診療的重要性，尤其是對于孕產(chǎn)婦和兒童的診療過程中發(fā)揮著重要作用。特別是在兒童群體中，系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病癥狀并不典型，往往容易誤診、漏診而耽誤治療。接下來宋教授介紹了目前國內(nèi)常見的自身抗體檢測方法，著重提到了間接免疫熒光、免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法，詳細(xì)介紹了每種檢測方法的優(yōu)勢和局限性。最后宋教授以指南為依據(jù)，推薦常見自身抗體檢測的策略。宋教授提到對于ANA檢測，推薦用間接免疫熒光法進(jìn)行ANA的總抗體篩查，同時(shí)對于ANA的特異性抗體，需要用免疫印跡法、化學(xué)發(fā)光法等進(jìn)行靶抗原確認(rèn)。由此保證ANA靶抗原的全面覆蓋及單指標(biāo)檢測的靈敏度，避免漏檢。對于抗dsDNA抗體，不但是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的特異性指標(biāo)，其滴度變化與疾病活動度密切相關(guān)，有隨訪監(jiān)測的價(jià)值。所以針對抗dsDNA抗體檢測，可應(yīng)用間接免疫熒光篩查，同時(shí)，ELISA和化學(xué)發(fā)光法等進(jìn)行定量監(jiān)測。對于ANCA是ANCA相關(guān)血管炎的重要血清學(xué)標(biāo)志。2017年國際ANCA檢測專家共識推薦IIFT和靶抗原確認(rèn)平行檢測或IIFT結(jié)果陽性，再進(jìn)行靶抗原確認(rèn)。

       學(xué)術(shù)報(bào)告后，李士軍教授主持討論環(huán)節(jié)，并與各位專家圍繞多方法學(xué)助力自身抗體實(shí)驗(yàn)室檢測相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行了深入的交流與分享。李教授結(jié)合本次會議的主題，以及線上觀眾的提問，提出了三個(gè)問題：

問題1：目前自身抗體檢測的方法眾多，其中化學(xué)發(fā)光自動化程度高，而且定量檢測，相比之下其他方法學(xué)還有存在的必要性么？

安成教授：從眾多文獻(xiàn)的報(bào)道上來看，其實(shí)不同的方法學(xué)，在檢測的結(jié)果上有互補(bǔ)的作用。因?yàn)椴煌臋z測方法，它檢測的敏感性是完全是不一樣的，特異性也不一樣，就像宋教授介紹的，每種方法學(xué)都有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值和局限性。例如間接免疫熒光，是以HEp-2細(xì)胞作為檢測基質(zhì)的經(jīng)典方法學(xué)，HEp-2是包含二百余種自身抗體靶抗原的“天然陣列”，以其作為基質(zhì)對ANA進(jìn)行IFA檢測，敏感性高，是目前公認(rèn)的ANA檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，是不能夠被其他方法學(xué)取代的。以及在指南中，也是推薦多方法學(xué)聯(lián)合檢測來降低漏診、誤診。比如：2018年國內(nèi)發(fā)布的ANCA檢測臨床應(yīng)用專家共識推薦以乙醇固定和甲醛固定的中性粒細(xì)胞為基質(zhì)的IIFT篩查及聯(lián)合ELISA確認(rèn)靶抗原，可有效提高AAV的臨床診斷性能。對于臨床疑似AAV患者，可采用ELISA或CLIA直接檢測靶抗原PR3和MPO。若檢測結(jié)果陰性，但臨床仍高度懷疑AAV，應(yīng)使用其他免疫學(xué)方法和/或IIFT-ANCA進(jìn)行重復(fù)檢測。此外，對于IIFT檢測，為了排除ANA的干擾，建議另采用HEp-2細(xì)胞+粒細(xì)胞（乙醇固定）基質(zhì)進(jìn)行輔助檢測。

周海舟教授：周教授同樣認(rèn)為化學(xué)發(fā)光法雖然優(yōu)勢明顯，但不能替代其他方法學(xué)。周教授舉例闡述。第一個(gè)例子是PLA2R檢測，目前是以間接免疫熒光和酶聯(lián)免疫吸附法為主要的檢測方法。間接免疫熒光使用的是細(xì)胞和組織為檢測基質(zhì)，保留了抗原的天然的構(gòu)象，所以它的敏感度是比較高的。而酶聯(lián)免疫吸附法檢測PLA2R特異性較強(qiáng)。目前梅奧診所對于檢測PLA2R給出的建議是間接免疫熒光和酶聯(lián)免疫吸附法共同檢測，保證了敏感性的同時(shí)，提高特異性。第二個(gè)例子是自身免疫性皮膚病的相關(guān)檢測，同樣也是間接免疫熒光和四種靶抗原BP180，BP230， Dsg-1和Dsg-3檢測同時(shí)進(jìn)行。間接免疫熒光方法學(xué)不但敏感性高，還可以區(qū)分是基底膜是表皮側(cè)還是真皮側(cè)陽性，但如果是表皮側(cè)陽性的那個(gè)提示呢，就是大皰性天皰瘡，而真皮側(cè)陽性，就提示是獲得性大皰性皮表皮松懈癥。而靶抗原檢測特異性較高，兩者結(jié)合不但能降低漏檢率，還能明確診斷，同時(shí)對臨床用藥選擇有一個(gè)很好的提示作用。

問題2：實(shí)際工作中，經(jīng)常會遇到不同方法學(xué)結(jié)果不一致的情況，對此現(xiàn)象一般如何處理和解決？

安成教授：安教授表示這個(gè)問題和第一個(gè)問題有一定的相關(guān)性。首先不同方法學(xué)采用的基質(zhì)或是抗原是不一樣的。間接免疫熒光檢測ANA使用的是HEp-2細(xì)胞為檢測基質(zhì)，敏感性是很好的。而且不同的核型也提示不同的疾病，對疾病的診療有著重要的作用。免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法使用的抗原都是經(jīng)過人工處理純化的，特異性很好。作為檢驗(yàn)人要把兩者結(jié)合應(yīng)用到臨床中去。

周海舟教授：周教授表示在實(shí)際工作中不僅是自身抗體檢測出現(xiàn)這種情況，其他的免疫檢測項(xiàng)目也會出現(xiàn)這種情況。常常是同一個(gè)患者在不同的醫(yī)院進(jìn)行檢測，出現(xiàn)檢測結(jié)果不一致的情況。針對這種情況我建議在復(fù)查時(shí)盡量在同一家醫(yī)院進(jìn)行檢測，同時(shí)明確檢測方法學(xué)，以便更換就診醫(yī)院時(shí)分析比對。最后周教授提出如果檢測項(xiàng)目有指南推薦的金標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，建議出現(xiàn)檢測結(jié)果按照金標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)出報(bào)告。比如雙鏈DNA的檢測，金標(biāo)準(zhǔn)就是使用綠蠅短膜蟲為基質(zhì)的間接免疫熒光法檢測。所以對于雙鏈DNA的檢測，如果出現(xiàn)不同檢測方法學(xué)不一致的情況，建議依據(jù)熒光結(jié)果來報(bào)告。

問題3：自身抗體檢測的室內(nèi)自制質(zhì)控品如何操作？又如何評價(jià)？

安成教授：自身抗體檢測的質(zhì)控品比較難以獲得，質(zhì)控品確實(shí)免不了要實(shí)驗(yàn)室自制。我們的自制質(zhì)控品就是從臨床上發(fā)現(xiàn)的一些樣本，然后進(jìn)行稀釋、評價(jià)、保存。自制質(zhì)控品的評價(jià)應(yīng)該包括重復(fù)性驗(yàn)證、均勻性驗(yàn)證、穩(wěn)定性驗(yàn)證等。以膜條印跡的ENA抗體質(zhì)控為例，會將收集到的不同陽性樣本混合在一起進(jìn)行評價(jià)，對一些難獲得、低濃度的抗體單獨(dú)加入反應(yīng)池中，防止樣本混合被稀釋而表現(xiàn)陰性。通常在2-8℃短可保存一周，但為了長期使用，需要放在-20℃條件下保存，為了避免反復(fù)凍融，可加入甘油，使其在-20℃條件下保持液體狀態(tài)，甘油的冰點(diǎn)和它的濃度相關(guān)，是一個(gè)U字形的關(guān)系，-25℃的冰點(diǎn)時(shí)，甘油的濃度在50%左右，-40℃的冰點(diǎn)時(shí)，甘油的濃度大約在60%左右，隨后隨著甘油濃度增加，冰點(diǎn)反而上升。穩(wěn)定性可通過破壞實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

周海舟教授：我們的自制質(zhì)控品也是使用的臨床樣本來制作，選擇無溶血、黃疸、脂血、乳糜及渾濁等樣本，然后進(jìn)行離心、稀釋。用于間接免疫熒光的質(zhì)控品一般稀釋到濃度1:320后進(jìn)行保存。我們對自制質(zhì)控品的評價(jià)同樣包括重復(fù)性驗(yàn)證、均勻性驗(yàn)證、穩(wěn)定性驗(yàn)證這幾個(gè)方面。

       最后，李士軍教授感謝一味書院的大力支持，感謝講者和討論嘉賓的精彩分享，感謝線上聽眾的積極參與和關(guān)注，感謝一味書院、歐蒙亞太集團(tuán)及各位在線工作人員的辛勤付出，至此論壇圓滿結(jié)束。

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